PCR, ポリメラーゼ連鎖反応とは、親 DNA を鋳型として、特定のプライマーを伸長の開始点として使用し、DNA ポリメラーゼの触媒作用の下でシステムに dNTP、Mg2+、伸長因子、および増幅促進因子を追加することを指します。変性、アニーリング、伸長などのステップを通じて、親鎖テンプレート DNA に相補的な娘鎖 DNA を in vitro で複製するプロセスにより、あらゆる標的 DNA を in vitro で迅速かつ特異的に増幅できます。
1. ホットスタート PCR
従来の PCR における増幅の開始時間は、PCR 装置を PCR 装置にセットしてからプログラムが増幅を開始することではありません。システム構築が完了すると増幅が開始され、非特異的な増幅が発生する場合がありますが、ホットスタート PCR はこの問題を解決します。
ホットスタート PCR とは何ですか?反応系を調製した後、反応の初期加熱段階または「ホットスタート」段階で高温（通常 90℃以上）で酵素修飾剤が放出され、DNA ポリメラーゼが活性化されます。正確な活性化時間と温度は、DNA ポリメラーゼとホットスタート修飾子の性質によって異なります。この方法では、主に抗体、アフィニティーリガンド、または化学修飾剤などの修飾剤を使用して DNA ポリメラーゼの活性を阻害します。DNA ポリメラーゼの活性は室温では阻害されるため、ホット スタート技術を使用すると、PCR 反応の特異性を犠牲にすることなく、室温で複数の PCR 反応系を調製するのに非常に便利です。
2. RT-PCR
RT-PCR (逆転写 PCR) は、mRNA から cDNA に逆転写し、それを増幅の鋳型として使用する実験手法です。実験手順は、最初に組織または細胞内のトータルRNAを抽出し、オリゴ(dT)をプライマーとして使用し、逆転写酵素を使用してcDNAを合成し、次にcDNAを鋳型としてPCR増幅して、標的遺伝子を取得または遺伝子発現を検出します。
3. 蛍光定量的 PCR
蛍光定量PCR（リアルタイム定量PCR、RT-qPCR) は、PCR 反応系に蛍光基を追加し、蛍光シグナルの蓄積を使用して PCR プロセス全体をリアルタイムで監視し、最後に標準曲線を使用してテンプレートを定量分析する方法を指します。一般的に使用される qPCR メソッドには、SYBR Green I および TaqMan が含まれます。
4. ネステッド PCR
ネステッド PCR とは、2 セットの PCR プライマーを 2 回の PCR 増幅に使用することを指し、2 回目の増幅産物が標的遺伝子断片となります。
最初のプライマー ペア (アウター プライマー) の不一致により非特異的産物が増幅された場合、同じ非特異的領域が 2 番目のプライマー ペアによって認識され、増幅が継続される可能性は非常に低いため、 2 番目のプライマーペアによる増幅により、PCR の特異性が向上しました。2 ラウンドの PCR を実行する利点の 1 つは、限られた開始 DNA から十分な産物を増幅するのに役立つことです。
5.タッチダウンPCR
タッチダウン PCR は、PCR サイクルのパラメーターを調整することで PCR 反応の特異性を向上させる方法です。
タッチダウン PCR では、最初の数サイクルのアニーリング温度は、プライマーの最大アニーリング温度 (Tm) より数度高く設定されます。アニーリング温度を高くすると非特異的増幅を効果的に低減できますが、同時にアニーリング温度が高くなるとプライマーとターゲット配列の分離が悪化して、PCR 収率が低下します。したがって、最初の数サイクルでは、システム内の標的遺伝子の含有量を増やすために、通常、アニーリング温度がサイクルごとに 1°C ずつ下がるように設定されます。アニーリング温度が最適温度まで低下すると、残りのサイクルではアニーリング温度が維持されます。
6. ダイレクト PCR
ダイレクト PCR とは、核酸の単離や精製を必要とせずに、サンプルから直接標的 DNA を増幅することを指します。
ダイレクト PCR には 2 つのタイプがあります。
直接法: 少量のサンプルを採取し、PCR を同定するために PCR マスター ミックスに直接加えます。
クラッキング方法：サンプルをサンプリングした後、それをライセートに加え、ゲノムを解放するために溶解し、少量の溶解した上清を採取してPCRマスターミックスに加え、PCR同定を実行します。このアプローチにより、実験のワークフローが簡素化され、実践時間が短縮され、精製ステップ中の DNA 損失が回避されます。
7. SOE PCR
オーバーラップエクステンション PCR (SOE PCR) による遺伝子スプライシングは、相補的な末端を持つプライマーを使用して PCR 産物がオーバーラップ鎖を形成するようにし、その後の増幅反応でオーバーラップ鎖の伸長を通じて、異なるソースの増幅断片をオーバーラップさせる技術です。そしてつなぎ合わせた。この技術には現在、融合遺伝子の構築という 2 つの主な応用方向があります。遺伝子部位特異的突然変異。
8. IPCR
インバース PCR (IPCR) では、逆相補プライマーを使用して 2 つのプライマー以外の DNA 断片を増幅し、既知の DNA 断片の両側にある未知の配列を増幅します。
IPCR は元々、隣接する未知領域の配列を決定するために設計されており、主に遺伝子プロモーター配列の研究に使用されています。遺伝子融合、転座、転位などの発がん性染色体再構成。部位特異的突然変異誘発の場合、目的の突然変異を持つプラスミドをコピーします。
9. dPCR
デジタル PCR (dPCR) は、核酸分子の絶対定量のための技術です。
現在、核酸分子の定量には 3 つの方法があります。測光は核酸分子の吸光度に基づいています。リアルタイム蛍光定量的 PCR (Real Time PCR) は Ct 値に基づいており、Ct 値は検出可能な蛍光値に対応するサイクル数を指します。デジタル PCR は、核酸を計数するための単一分子 PCR 法に基づいた最新の定量技術です。定量化は絶対的な定量法です。
投稿日時: 2023 年 6 月 13 日