限外濾過遠心管の使用方法と注意事項
1) 適切な限外濾過チューブを選択します。UF メンブレンはさまざまな化学物質に対する耐性のレベルが異なることに注意してください。通常、10 kDa の分子量カットオフを持つ限外濾過チューブは、35 kDa など、目的のタンパク質の分子量の 1/3 を超えない分子量カットオフで選択できます。目的のタンパク質の分子量が約 10 kd の場合、分子量カットオフが 3 kd の限外濾過チューブを使用できます。
(2) 購入したばかりの限外濾過は乾燥しており、使用前に超純水を加え、水を完全に膜に通過させ、氷浴または冷蔵庫で数分間予冷します。次に、水、つまりタンパク質液体を注ぎ出し、チューブの上部にある白い線を超えない量を加えます。操作は軽く、タンパク質溶液を加える前に限外濾過チューブを氷上で予冷する必要があります。
3) 質量と重心の両方がバランスに達すること。回転速度と加速度があまり速くない場合、限外濾過膜に直接損傷を与えることに注意してください。遠心限外濾過を開始した(遠心分離機は4度に予冷した)。異なる遠心分離機の RPM を g に換算すると、異なりました。遠心分離機の加速度を最小限に調整し、膜にかかる圧力を下げました。遠心分離機が目的の速度に達した後は必ず遠心分離機から離れるようにしてください。そうしないと、問題が発生した場合、初めてでは対処できなくなります。スピンドルに対する膜の向きを説明書に従って調整した（角度付き遠心分離機の場合は膜が軸に対して垂直である）。実際の使用では、遠沈管の寿命を延ばすことができるよう、一般的な回転速度は説明書に記載されている速度よりも低くなります。
3) 質量と重心の両方がバランスに達すること。回転速度と加速度があまり速くない場合、限外濾過膜に直接損傷を与えることに注意してください。遠心限外濾過を開始した(遠心分離機は4度に予冷した)。異なる遠心分離機の RPM を g に換算すると、異なりました。遠心分離機の加速度を最小限に調整し、膜にかかる圧力を下げました。遠心分離機が目的の速度に達した後は必ず遠心分離機から離れるようにしてください。そうしないと、問題が発生した場合、初めてでは対処できなくなります。スピンドルに対する膜の向きを説明書に従って調整した（角度付き遠心分離機の場合は膜が軸に対して垂直である）。実際の使用では、遠沈管の寿命を延ばすため、説明書に記載されている回転数よりも一般的な回転数が低くなります。
(4) 残り 1ml まで濃縮したら、緩衝液 50μl をとり、フロースルー 10μl を加え、青色になるかどうかを確認し、限外濾過チューブにタンパク質が欠落しているかどうかを判断します。チューブに漏れがある場合は、上層を再度注ぎ、新しいチューブに流し込み、限外濾過を開始します。チューブが抜け落ちたかどうかを正確に判断するには、フロースルーの前に 5mgml の BSA で 10 分間遠心分離し、タンパク質接着剤またはブラッドフォード粗分析を実行し、残りの濃縮タンパク質溶液 (氷上で操作し、タンパク質の加熱を防ぐ) を追加して続けます。濃縮物をすべて加えました。遠心分離中にタンパク質の沈殿が生じ、チューブが閉塞してしまう場合には注意してください。沈殿が発生した場合は、沈殿の具体的な原因が過剰なタンパク質濃度であるか、不適切なバッファーであるかを判断します。前者は複数の限外濾過チューブを同時に限外濾過して濃度を下げることで解決でき、後者はタンパク質が沈殿しなくなるまで異なる緩衝液を交換することで解決できます。
(4) 残り 1ml まで濃縮したら、緩衝液 50μl をとり、フロースルー 10μl を加え、青色になるかどうかを確認し、限外濾過チューブにタンパク質が欠落しているかどうかを判断します。チューブに漏れがある場合は、上層を再度注ぎ、新しいチューブに流し込み、限外濾過を開始します。チューブが抜け落ちたかどうかを正確に判断するには、フロースルーの前に 5mgml の BSA で 10 分間遠心分離し、タンパク質接着剤またはブラッドフォード粗分析を実行し、残りの濃縮タンパク質溶液 (氷上で操作し、タンパク質の加熱を防ぐ) を追加して続けます。濃縮物をすべて加えました。遠心分離中にタンパク質の沈殿が生じ、チューブが閉塞してしまう場合には注意してください。沈殿が発生した場合は、沈殿の具体的な原因が過剰なタンパク質濃度であるか、不適切なバッファーであるかを判断します。前者は複数の限外濾過チューブを同時に限外濾過して濃度を下げることで解決でき、後者はタンパク質が沈殿しなくなるまで異なる緩衝液を交換することで解決できます。
(5) 最初の数ステップはタンパク質を濃縮するために使用され、バッファーを変更する場合は、新しいバッファー (0.22um 限外濾過膜による限外濾過) を約 1 ml の全タンパク質に静かに加え、3 回で約 1 ml に再濃縮します。最終濃縮最終体積は、所望のタンパク質濃度に応じて、一般に５００μｌ以下であるが、２００μｌ以内である場合もある。3 回で 1000 倍以上を達成します。これは、毎回少なくとも 10 倍程度の体積濃縮によって計算される、基本的に同じ量のバッファー変化です。
(5) 最初の数ステップはタンパク質を濃縮するために使用され、バッファーを変更する場合は、新しいバッファー (0.22um 限外濾過膜による限外濾過) を約 1 ml の全タンパク質に静かに加え、3 回で約 1 ml に再濃縮します。最終濃縮最終体積は、所望のタンパク質濃度に応じて、一般に５００μｌ以下であるが、２００μｌ以内である場合もある。3 回で 1000 倍以上を達成します。これは、毎回少なくとも 10 倍程度の体積濃縮によって計算される、基本的に同じ量のバッファー変化です。
投稿時間: 2022 年 11 月 9 日